Sau khi ngăn chặn âm mưu trước đó của Bowser nhằm cưới Công chúa Peach; Mario và Luigi giờ đây phải đối mặt với mối đe dọa mới từ Bowser Jr., kẻ quyết tâm giải thoát cha mình khỏi cảnh giam cầm và khôi phục lại gia sản gia tộc. Cùng với những người bạn đồng hành cũ và mới, hai anh em du hành xuyên vũ trụ để ngăn chặn cuộc thập tự chinh của người thừa kế trẻ tuổi.